作业帮PCR扩增1829BP的片段,一对引物的Tm都是64度,退火温度已经试过55和50度都没有目的条带,请教pcr设置参数在55和50度只看到引物二聚体且有拖尾现象,没有目的条带
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/04 07:38:32
PCR扩增1829BP的片段,一对引物的Tm都是64度,退火温度已经试过55和50度都没有目的条带,请教pcr设置参数在55和50度只看到引物二聚体且有拖尾现象,没有目的条带
PCR扩增1829BP的片段,一对引物的Tm都是64度,退火温度已经试过55和50度都没有目的条带,请教pcr设置参数
在55和50度只看到引物二聚体且有拖尾现象,没有目的条带
PCR扩增1829BP的片段,一对引物的Tm都是64度,退火温度已经试过55和50度都没有目的条带,请教pcr设置参数在55和50度只看到引物二聚体且有拖尾现象,没有目的条带
首先,要确定引物设计成功了啊.
其次,确定试剂都是好的.
再次,确定模板DNA是没有降解太厉害.
还有就是PCR房间温度要控制在室温状态.
像这种夏天要要保持在25--30度室温.
以上都确定了之后,我建议你设计一下touchdown程序（每个循环降0.5度,这个具体程序你去查查,既可以减少非特异扩增,而且不用摸退火温度条件）.
你还可以摸摸温度梯度咯.这个程序就是那个Gradient选项（前提你的PCR仪是可以做温度梯度的PCR）.
如果所有的温度梯度都扩增不出来,我就倾向于是你的引物设计不好了.
一般退火温度越高,越不容易出现非特异,它对引物和模板的匹配要求很高.如果扩增不出来,可以考虑降低退火温度,这样虽然容易出现非特异片段,但是目的片段也相应容易扩增出来.
很大的可能是你模板的问题。你再重新提一次。然后55 57 60 62各做几次，循环数比你现在的循环数再多10左右。 试试看。
实验就是靠一边做，一边分析的。
我最近也在扩增霉菌的18SrDNA,其大小为1600左右的片段，很你的情况一样，没有目的片段，只是在100bpMarker处有不清晰的条带，师兄说是引物二聚体，后来我更换了试剂也试了很多次，还那样，后来我重新合成了引物，结果一下子就出来了，你也可以试试，合成引物也不贵，我合成的才60几块钱，...
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我最近也在扩增霉菌的18SrDNA,其大小为1600左右的片段，很你的情况一样，没有目的片段，只是在100bpMarker处有不清晰的条带，师兄说是引物二聚体，后来我更换了试剂也试了很多次，还那样，后来我重新合成了引物，结果一下子就出来了，你也可以试试，合成引物也不贵，我合成的才60几块钱，
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