作业帮15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/04/27 17:45:23
15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤
15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤
15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤
实验步骤：
凝胶的制备：
1、 清洗干净两块玻璃板,晾干后按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边,防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.
2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角.把玻璃板在灌胶支架上固定好.
3、 分离胶：按1∶3∶8∶水=1∶2∶4∶1的比例,先将贮备液1,3和水放在一小烧杯中,过硫酸铵贮备液放在另一小烧杯中,取出将过硫酸铵溶液并入,用玻棒轻轻搅动使之混合,立即注于干洁的玻璃板中.玻璃板垂直放置,用滴管吸取混合液,沿管壁注入,注意不要进入气泡.胶液注到离玻璃板口2cm处,立即在其表面覆盖少量蒸馏水,静置1小时左右,当见到水层下面有一清晰的界面时,则表明胶已聚合凝固,用吸水纸小心吸去上面水层.
4、 浓缩胶：按2∶4∶5∶6=1∶2∶1∶4的比例,同上法制备浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.
电泳步骤：
1、 拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖.
2、 用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟,去掉亚稳态聚合.
3、 电泳槽中加入缓冲液,接通电源,进行电泳,开始电流恒定在10mA,当进入分离胶后改为20mA,溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时,停止电泳.
4、 凝胶板剥离与染色：电泳结束后,撬开玻璃板,将凝胶板做好标记后放在大培养皿内,加入染色液,染色1小时左右.
5、 脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次,再用脱色液脱色,直到区带清晰.
6、 实验结果分析.
注意事项：
1、 固定玻璃板时,两边用力一定要均匀,防止夹坏玻璃板.
2、 凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.
3、 水封的目的是为了使分离胶上延平直,并排除气泡.
4、 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.
5、 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.
6、 要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.
7、 注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散.
8、 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.
9、 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.